預(yù)期應(yīng)用
ELISA法定量測定植物植物組織、細胞或其它相關(guān)樣本中ABA含量。
 
實驗原理
用純化的ABA抗體包被微孔板，制成固相載體，往微孔中依次加入標本或標準品、生物素化的ABA抗體、HRP標記的親和素，經(jīng)過*洗滌后用底物（TMB）顯色。TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的。顏色的深淺和樣品中的ABA呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（ 值），計算樣品濃度。
 
試劑盒組成及試劑配制
1、 酶標板：一塊（96孔）
2、 標準品（凍干品）： 2瓶，請臨用前15分鐘內(nèi)配制。每瓶以樣品稀釋液稀釋至1ml，蓋好后室溫靜置大約10分鐘，同時反復(fù)顛倒/搓動以助溶解，其濃度為100 nmol/ml，然后做系列倍比稀釋（注：不要直接在板中進行倍比稀釋），分別配制成100 nmol/ml，50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.25 nmol/ml，3.12 nmol/ml，1.56 nmol/ml，樣品稀釋液直接作為空白孔 0 nmol/ml。如配制50 nmol/ml標準品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）100 nmol/ml的上述標準品加入含有0.5ml樣品稀釋液的Eppendorf管中，混勻即可，其余濃度以此類推。
3、 樣品稀釋液：1×20ml。
4、 檢測稀釋液A：1×10ml。
5、 檢測稀釋液B：1×10ml。
6、 檢測溶液A：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液A 1:100稀釋（如：10 檢測溶液A / 990 檢測稀釋液A），充分混勻，稀釋前根據(jù)預(yù)先計算好的每次實驗所需的總量配制（100 /孔），實際配制時應(yīng)多配制  0.1-0.2ml。
7、 檢測溶液B：1×120 /瓶（1:100）。臨用前以檢測稀釋液B 1:100稀釋。稀釋方法同檢測溶液A。
8、 底物溶液：1×10ml/瓶。
9、 濃洗滌液：1×30ml/瓶，使用時每瓶用蒸餾水稀釋25倍。
10、終止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。
11、覆膜：5張
12、使用說明書：1份
 
 
 
自備物品
1、 酶標儀（建議儀器使用前提前預(yù)熱）
2、 微量加液器及吸頭，EP管
3、 蒸餾水或去離子水，濾紙
 
植物標本的采集及保存

1、 新鮮植物組織請在液氮中充分研磨；

2、 加入樣品體積3倍的提取液（10% TCA）, 置于-20 過夜；

3、 請于4 ，8000rpm，離心1小時，棄上清，收集沉淀；

4、 沉淀加入等體積的冰浴丙酮，混勻后于4 離心（8000rpm，15分鐘），棄上清并真空干燥，保存?zhèn)溆茫?/p>

5、 上樣前加入裂解液（2.7g 尿素，0.2g CHAPS，溶于去離子水中至終體積5ml），混勻后室溫放置30分鐘，然后4 離心（8000rpm，15分鐘），取上清并暫時保存于4 待用。
注：以上標本均應(yīng)密封保存，4 保存應(yīng)小于1周，-20 不應(yīng)超過1個月，-80 不應(yīng)超過2個月；
 
操作步驟
實驗開始前，各試劑均應(yīng)平衡至室溫，試劑不能直接在37 溶解；試劑或樣品配制時，均需充分混勻，混勻時盡量避免起泡。實驗前應(yīng)預(yù)測樣品含量，如樣品濃度過高時，應(yīng)對樣品進行稀釋，以使稀釋后的樣品符合試劑盒的檢測范圍，計算時再乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。
1、 加樣：分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓准訕悠废♂屢?100 ，余孔分別加標準品或待測樣品100 ，注意不要有氣泡，加樣 時將樣品加于酶標板底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37 溫育2小時。為保證實驗結(jié)果有效
性，每次實驗請使用新的標準品溶液。
2、 棄去液體，甩干，不用洗滌。每孔加檢測溶液A工作液 100 （臨用前配制），酶標板加上覆膜，37 溫育1小時。
3、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分鐘，大約400 /每孔，甩干（也可輕拍將孔內(nèi)液體拍干）。
4、 每孔加檢測溶液B工作液（臨用前配制）100 ，加上覆膜，37 溫育1小時。
5、 棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5次，方法同步驟3。
6、 每孔加底物溶液90 ，酶標板加上覆膜37 避光顯色（反應(yīng)時間控制在15-30分鐘，當(dāng)標準孔的前3-4孔有明顯的梯度藍色，后3-4孔梯度不明顯時，即可終止）。
7、 每孔加終止溶液50 ，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)。終止液的加入順序應(yīng)盡量與底物    液的加入順序相同。
8、 立即用酶標儀在450nm波長測量各孔的光密度（ 值）。
 
注：
1、 試劑準備：所有試劑在使用前應(yīng)平衡至室溫，使用后請立即按照說明書要求保存試劑。實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。
2、 加樣：加樣或加試劑時，*個孔與zui后一個孔加樣之間的時間間隔如果太大，將會導(dǎo)致不同的 “預(yù)溫育”時間，從而明顯地影響到測量值的準確性及重復(fù)性。一次加樣時間（包括標準品及所有樣品）控制在10分鐘內(nèi)。推薦設(shè)置復(fù)孔進行實驗。
3、 溫育：為防止樣品蒸發(fā)，實驗時將加上蓋或覆膜的酶標板置于濕盒內(nèi)，以避免液體蒸發(fā)；洗板后應(yīng)盡快進行下步操作，任何時侯都應(yīng)避免酶標板處于干燥狀態(tài)；同時應(yīng)嚴格遵守給定的溫育時間和溫度。
4、 洗滌：洗滌過程中反應(yīng)孔中殘留的洗滌液應(yīng)在濾紙上拍干，勿將濾紙直接放入反應(yīng)孔中吸水，同時要消除板底殘留的液體和手指印，避免影響zui后的酶標儀讀數(shù)。
5、 試劑配制：Detection A及Detection B在使用前請手甩幾下或少時離心處理，以使管壁或瓶蓋的液體沉積到管底。標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液請依據(jù)所需的量配制使用，并使用相應(yīng)的稀釋液配制，不能混淆。請配制標準品及工作液，盡量不要微量配制（如吸取檢測溶液A時，一次不要小于10 ），以避免由于不準確稀  釋而造成濃度誤差；請勿重復(fù)使用已稀釋過的標準品、檢測溶液A工作液、檢測溶液B工作液。
6、 反應(yīng)時間的控制：加入底物后請定時觀察反應(yīng)孔的顏色變化（比如，每隔10分鐘），如顏色較深，請?zhí)崆凹尤虢K止液終止反應(yīng)，避免反應(yīng)過強從而影響酶標儀光密度讀數(shù)。
7、 底物：底物請避光保存，在儲存和溫育時避免強光直接照射。
    
洗板方法
1、 手工洗板方法：將推薦的洗滌緩沖液至少0.4ml注入孔內(nèi)，浸泡1-2分鐘，吸去（不可觸及板壁）或甩掉酶標板內(nèi)的液體，在實驗臺上鋪墊幾層吸水紙，酶標板朝下用力拍幾次；根據(jù)需要，重復(fù)此過程數(shù)次。
2、 自動洗板：如果有自動洗板機，應(yīng)在熟練使用后再用到正式實驗過程中。
 
特異性
    本試劑盒可同時檢測重組或天然的植物ABA，且與其它相關(guān)蛋白無交叉反應(yīng)。
 
計算
  各標準品及樣本 值扣除空白孔 值后作圖（七點圖），如設(shè)置復(fù)孔，則 應(yīng)取其平均值計算。以標準品的濃度為縱坐標（對數(shù)坐標）， 值為橫坐標（對數(shù)坐標），在對數(shù)坐標紙上繪出標準曲線。推薦使用專業(yè)制作曲線軟件進行分析，如 curve expert 1.3，根據(jù)樣品 值，由標準曲線查出相應(yīng)的濃度，乘以稀釋倍數(shù)；或用標準物的濃度與 值計算出標準曲線的回歸方程式，將樣品的 值代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。
 
檢測范圍： 1.56 nmol/ml - 100 nmol/ml，繪制標準曲線請取用以下濃度值：100 nmol/ml，50 nmol/ml，25 nmol/ml，12.5 nmol/ml，6.25 nmol/ml，3.12 nmol/ml，1.56 nmol/ml。
 
zui低檢測限：0.39 nmol/ml
 
ELISA試劑盒